多重免疫组化技术助力肿瘤精准治疗 -提供可视化肿瘤微环境信息-迈杰转化医学

多重免疫组化技术助力肿瘤精准治疗 -提供可视化肿瘤微环境信息

返回列表 来源：发布日期： 2020.07.07

肿瘤微环境（ T um o r M ic r oe n vi r on m en t ，T ME）是一个复杂的综合系统，主要由肿瘤细胞、周围的免疫和炎症细胞、肿瘤相关的成纤维细胞、附近的间质组织、微血管、各种细胞因子和趋化因子构成。肿瘤细胞与其所处的微环境作为一个功能整体，两者相互影响、共同进化，所以肿瘤的发生与发展不仅与肿瘤细胞本身相关，同样与 TME密切相关 ^{[ 1]} 。在过去的十年中， TM E已经成为癌症治疗最重要的研究对象之一 ^{[ 2]} 。

随着精准医疗的发展，在各类癌症的免疫治疗应用中，对临床评估T ME的需求也越来越强烈^[3-5] ，而当下免疫肿瘤学研究多集中在特定免疫细胞亚群在其空间环境中的作用。对 TME 更深层次信息的需求推动了新技术的发展，如多路成像^[6] 、质谱流式细胞术 ^{[ 7]} 及单细胞 R NA 测序 ^{[ 8]} 。虽然质谱流式细胞术和单细胞测序是研究 TM E 的有效方法，但无法很好地解释肿瘤细胞与周围各要素之间的空间联系。

利用免疫学和细胞化学原理，多重免疫组化（M u lt ipl e I mmuno his toche m istry , mIHC ）技术通过在同一张切片上同时或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，来原位示踪组织或细胞内不同的抗原大分子物质。 mI HC采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示。

与大规模细胞检测和单细胞转录分析相比， mI H C技术不仅可以使 FFPE样本在更好的分辨率下显示肿瘤细胞与TME的关系，而且其技术原理相对成熟且操作便捷，在TM E 研究中具有独到的优势^[10] 。

mIHC 检测肿瘤微环境相关信息，为免疫治疗提供更全面评估

在肿瘤精准治疗时代，现有的生物标志物识别模式（即根据特定基因的突变检测结果预测药效）并不适用于所有受到免疫治疗的患者 ^{[11 ]} 。肿瘤的异质性决定了其肿瘤微环境的复杂性，而肿瘤中免疫细胞的活化/ 抑制状态、免疫细胞密度、肿瘤细胞之间的空间位置甚至肿瘤内微血管的生成等都将对免疫治疗的应答评估产生重要影响。多种途径共同决定了肿瘤和免疫细胞之间的相互作用，将这种相互作用精炼到一个单一的生物标志物提升了靶向药物或免疫药物的有效率，但是从某种程度上讲也是一种过分简化 ^{[ 1 1 ]} 。

Taube等人通过mIHC对非小细胞肺癌石蜡包埋组织切片进行处理。结果发现肿瘤细胞与CD68+巨噬细胞均表达PD-L1，罕见的CD8+ T细胞部分表达PD-1，同时环境中存在FoxP3+调节性t细胞（图1） ^{[ 11
]} 。研究人员认为，未来的生物标志物策略无疑将包括对肿瘤先天和适应性免疫反应以及肿瘤本身内在特征的更全面的评估。肿瘤微环境在某些肿瘤类型中被认为与预后独立相关，未来基于TNM分期系统的肿瘤分期标准可能会将免疫相关指标综合考虑在内 ^{[ 11
]} 。

图1. 非小细胞肺癌mIHC（福尔马林固定，石蜡包埋切片，橙色肿瘤细胞，紫色 CD68+巨噬细胞，绿色 PD-L1，黄色 CD8+ t细胞，青色PD-1，红色 FoxP3+调节性t细胞，蓝色 DAPI ）

mIHC/IF 联合多种生物标志物预测免疫治疗效果或更具准确性

一项20 19 年 7月发表在《 JA M AO n co l 》囊括了1 0余种不同实体肿瘤类型的81 3 5名患者的研究显示，m I HC/IF 和多种生物标志物联用策略，或比仅P D -L1 IHC 、肿瘤突变负荷（T MB）或基因表达谱（ GEP ）的免疫治疗疗效预测性能更佳^[9] 。

研究共分析了 8 13 5 名患者代表、 10 余种不同实体肿瘤类型的肿瘤标本。在此研究中，T M B、PD- L 1 IHC 、 GEP的预测性能相似，而mI H C/I F 和多种生物标志物联用策略或比单一 PD-L 1 IH C 、TMB 或 GEP的性能更强^[9] 。

不可否认的是， mI H C/ I F对免疫治疗应答的预测效果还需进一步研究来证实，但不失为一种具有潜力的免疫治疗预测方法。

迈杰转化医学mIHC整体解决方案

迈杰转化医学研究（苏州）有限公司已经建立并完善了多色免疫组织化学染色的技术平台和多个检测pan e l的方法学验证，能够对组织切片中多达6个免疫荧光标记物进行成像和分析（图 2 ，6个免疫荧光标记物+ 1个核染色），可以对实体肿瘤微环境中的细胞表型和活性进行精准定量评估，同时提供了组织背景和细胞间相互作用的空间信息，具有卓越的技术方法优势。

图2. 乳腺癌组织7色mIHC染色（红色CD20 ；黄色CD8 ；绿色CD4 ；洋红色：PD-L1 ；青色：细胞角蛋白 ；橙色FoxP3 ；蓝色：细胞核 ）

迈杰转化医学 m IH C 工作流程包含三个主要环节：荧光标记 -多光谱成像-组织图像分析。通过活性荧光团共价标记表位，多光谱成像则消除了荧光团的串扰和组织自发荧光的干扰，允许对组织样本中的每个荧光信号进行精确检测。组织图像分析确定了每个细胞和每个亚细胞间室的荧光强度值并形成可视化图像。部分已验证组合见迈杰转化医学 mIHC 成像示例图（图 3）。

图3a. 扁桃体组织的 P D- L 1 &C D 4& C D8 mI H C染色（迈杰荧光合成图像， 红色PD-L1 ，黄色CD4 ，绿色CD8 ，蓝色DAPI ） ; 图 3b. 扁桃体组织的VI M&Gr z B&C D4& C D8 mI HC 染色（迈杰荧光合成图像， 橙色 VIM ， 红色GrzB ， 黄色CD4 ， 绿色CD8 ， 蓝色DAPI ） ; 图 3c . 扁桃体组织的 CD 80 &P D- L1 &C D16 3 &CD 2 06 mIH C 染色（迈杰荧光合成图像， 青色 CD80 ， 红色PD-L1 ， 黄色CD163 ， 绿色CD206 ， 蓝色DAPI ）

结合机器学习算法，分析系统能够识别组织的形态学区域（如肿瘤、真皮、基质、炎症），并提供每个区域的细胞计数和密度，以进一步分析（如特定细胞表型之间的距离映射）。除了荧光合成图像，分析系统还能够提供模拟亮场单色 IHC ，以改进目视判读。

作为一种极具潜力的免疫治疗预测方法， m IH C正逐渐出现在肿瘤相关领域研究者的视野中。一个对G C 样本的研究表明，mIH C 能够精确地显示具有复杂免疫表型的各种免疫细胞，以此表征 TME 。细胞角蛋白染色结果图像的数字分割可以显示瘤内和瘤周 TM E的空间信息 ^[10] 。通过对mI HC 结果的进一步图像分析，研究人员能够实现分子的亚细胞定位，进一步拓展m IHC 的应用 ^{[ 10 ]} 。

参考文献

[ 1] I mm u no g en o mi c p rof ili ng deter mi nes resp on ses to com bi ned PARP a nd P D-1 i nhi b iti o n i n ov a ria n ca n cer. Natu r e Com m unica t ions. 2 020

[ 2] H al l ma r ks of ca n ce r: the next genera t ion. C ell. 2 011

[ 3] I mp r ov e d s ur v iv a l wit h i pilim uma b i n p ati ent s w ith me tas tat ic m ela n oma . N E ngl J Me d . 20 10

[ 4] P D- 1 b l oc k ad e w ith nivo lumab in rela pse d o r r efr act ory Ho dgk in' s l ymp h oma . NE n gl J Me d . 2 0 15

[ 5] P em b ro l iz u ma b f or the t reatme nt of non- sm all- ce ll l un g ca nc er. N En gl J M ed .2 01 5

[ 6] C om p re h en s iv e i ntr ame ta static i mmune quanti f icati o n and major impac t of i mmu n osc o re o n s u rvi v al J Nat l Can ce r In s t. 20 1 8.

[ 7] Q ua n ti t at i ve mu l ti ple x i mmuno his toche m istry revea l s mye l oid-i n flam e dtu m or- i mmu n e c o mpl e xit y ass oci at ed wit h poor p rogno s is. Ce l l R e p . 2 0 1 7

[ 8] H ig h ly mu l ti p le x ed imagi ng o f tumor ti ssue s with s ubce ll ular r es olut ion b y m a ssc y tom e try . Nat Me th od s. 2 0 14

[ 9] C om p ar i so n o f B iom ark er Modal it ies for Pr edic ti ng R es pons e to P D-1/ PD -L 1C he ck po in t Bl oc ka de : A S y stem a tic R evie w and Me ta-an al ysis. J AM A On co l, 2 01 9

[ 10 ] Hi g h- T hr o ug h pu t M ult ipl ex Im mun ohist o chemi c al Im a ging o f t he T umo r an d It s Mic r oen v iro n men t, Ca nc er Re s Tr ea t, 2 02 0