【杰论系列】CAR-T慢病毒整合位点检测浅析

主要内容

一、CAR-T治疗

二、CAR-T慢病毒载体整合的潜在安全性隐患

三、 载体整合位点检测成为CAR-T治疗方法临床试验的安全性评估的硬性要求

四、 单克隆扩增=癌变？相反的，可能是疗效持久的正面信号

五、 慢病毒整合事件要素及检测方法要求

六、 慢病毒整合位点检测方法

七、 迈杰转化医学慢病毒检测服务

CAR-T治疗

2021年6月22日，复星凯特生物科技有限公司CAR-T细胞治疗产品益基利仑赛注射液正式获得NMPA批准,中国迎来首款获批上市的CAR-T细胞治疗产品，中国CAR-T细胞治疗行业也进入了新的竞争格局。CAR-T，全称是Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，指的是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。通过基因转导方法转染T淋巴细胞，赋予T细胞肿瘤靶向性、更强的杀伤活性和持久的杀伤力。从而使其能特异性地识别和高效杀伤肿瘤细胞。

目前全球共有5款 CAR-T疗法获批上市，4款靶向CD19，1款靶向BCMA，分别是诺华的Kymriah，吉利德的Yescarta和Tecartus（2017年10月、2020年7月获批），百时美施贵宝的Breyanzi 和Abecma（2021年2月、2021年3月获批）。CAR-T疗法的未来市场前景乐观。

CAR-T慢病毒载体整合的潜在安全性隐患

包括CAR-T治疗在内的基因编辑性细胞治疗方法，采用慢病毒整合性载体将外源基因插入整合到细胞基因组中，某些插入位置可能会导致关键基因突变或激活原癌基因，从而导致恶性肿瘤风险增加。因载体整合导致致瘤性基因变异及新发细胞癌变称为二次成瘤。在持续性细胞治疗过程中，这种潜在的成瘤性不良反应的发生时间往往会有明显的滞后性且很难预测。因此CAR-T治疗需要评估潜在的插入突变风险和致癌性风险。

2018年诺华CTL019的一项临床试验[NCT01626495]中，一名B-ALL病人在接受CAR-CD19治疗28天后即达到CR，却在6个月后复发，PCR检测没有发现任何的RCL，结合持续性慢病毒插入位点的克隆丰度分析，研究者最终发现一个携带CAR插入位点的CAR-B细胞克隆。进而发现这个B细胞是CAR-T生产过程中的一个CAR-B副产物，而CAR在该B细胞上的顺式插入表达导致CAR靶标表位屏蔽，导致该B细胞克隆的耐药。这个案例也提示除去CAR-T治疗方法本身的潜在风险外，CAR-T在生产工艺也会产生二次成瘤的风险。（见图1）[Ruella2018]

图1

载体整合位点检测成为CAR-T治疗方法临床试验的安全性评估的硬性要求

2020年9月发布的《细胞治疗产品申请临床试验药学研究和申报资料的考虑要点》“生产工艺开发的技术要求”及“质量研究和质量控制中的安全性研究”部分要求提供目的基因在染色体中的整合情况及提供细胞恶性转化（成瘤性和致瘤性）进行安全性研究和评估内容。2020年2月发布的《免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》中规定：探索性临床试验的安全性和耐受性要考虑"外源基因随机整合到细胞基因组形成插入突变，导致成瘤性和恶性转化等"。对确证性临床试验的疗效和安全性要求:“继续监测安全性风险，分析重要的已知和潜在的风险信息，包括迟发性不良事件(如致瘤性)的发生率、 严重性和危险因素等，并有必要采取措施使风险最小化。" 2021年2月发布的《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》则明确将"插入突变风险评估"作为非临床安全性研究的内容，并详细规定关键风险因素的评估要点。可见慢病毒载体整合位点检测已经成为细胞治疗产品IND评审及临床试验安全性评估的必检内容。

单克隆扩增=癌变？相反的，可能是疗效持久的正面信号

那么在临床过程中发现迟发性单克隆慢病毒整合增殖就一定高度怀疑二次成瘤吗？其实CAR-T治疗到目前为止还没有导致T细胞恶性肿瘤的报告。一项调查年到2017年CAR-CD19临床I/II期ALL、NHL、CLL病人的回顾数据显示，研究队列中NHL患者有11%的继发性恶性肿瘤发生率，与NHL 常规治疗后继发性恶性肿瘤的预期发生率相似 (4–10%) [cordeiro20:_late_event_treat_cd19_target]。

单克隆高度扩增可能维持药物持久性而非癌变，一项CAR-CD19在CLL中的临床试验发现，尽管CAR-CD19对CLL的临床效果不甚理想，但有一例病人的治疗效果非常好。病人在6个月后达到MRD阴性，CAR-T细胞在4.2年后仍然可以在外周血检测到，并且骨髓中检测不到B细胞肿瘤克隆。二代测序整合位点分析显示这是因为某些CAR-T细胞的融合位置位于TET2基因9号到10号外显子之间可变剪切区域，导致TET2基因跳读和功能障碍，从而产生短寿命记忆细胞扩增和长寿命记忆细胞。使得药物可以持久作用于病人。（如图2图3）[Fraietta2018]

图2

图3

研究者继而进行插入位点和CAR-T细胞扩增及持续作用时间的相关研究，利用慢病毒插入位点信息（INSPIIRED）和LASSO logistic 回归模型进行插入位置和药效学分析，初步建立预测模型。研究者还建议在CAR-T产品回输前进行类似的多变量预测可以对产品的安全性和有效性进行更为有效的评估。（如图3）[Nobles2020]

慢病毒整合事件要素及检测方法要求

对于食药监局指导性文件和既往研究内容，我们不难发现对于慢病毒整合检测所谓整合事件至少包含三个要素：

✦整合位置

✦整合方向

✦特定整合位置和整合方向的绝对克隆数目

因此检测在定性和定量性能方面都有要求，检测方法需要结合临床样本进行分析性能进行系统验证。

慢病毒整合位点检测方法

目前检测慢病毒整合位点的主要平台为高深度测序（NGS)。而目前较为成熟已经应用于工业产品检测及临床研究的整合位点富集建库方法为机械片段化及依赖于接头的扩增子建库(LM-PCR,如INSPIIRED), 已经应用于多个CART19临床项目的安全性评估及与CAR-T细胞增值相关的回顾性药效学分析。

迈杰转化医学慢病毒检测服务

迈杰转化医学慢病毒整合检测方法为自主开发的基于巢式LM-PCR的方法，采用独特的“剃刀”UMI接头技术和优化的数据分析流程，检测试剂和分析方法已经分别申请发明专利和软件著作知识产权。方法经过了严格的系统性能验证，可提供临床前CDE技术评审技术研究材料提交和临床产品质控和临床样本检测，目前已经服务于10余个申办方客户。

迈杰转化医学慢病毒检测系统验证部分性能展示：

✦线性及线性范围

在克隆丰度0.5%到30%的范围内，期望克隆丰度和检测克隆丰度的线性相关大于0.95。（如图4）

图4

✦定量准确度

线性范围内，克隆数目重复检测cv小于20%。（如图5）

 

图5

✦灵敏度

反应体系可以稳定检出反应体系中7个拷贝的克隆事件。克隆检出能力在不同的底物量下无差别。在500ng的标准检测底物量下，检测灵敏度为0.01～0.02copies/ng。（如图6）

 

图6

✦整合位置准确度

7个单克隆整合位点（4样本）检出整合位置和整合方向与Sanger测序完全一致。

✦样本长期稳定性

在-20℃下保存6个月，克隆丰度检测所有样本 cv<20%。

✦项目报告展示（如图7）

 

图7

参考文献

1.[Ruella2018] Induction of resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of a single leukemic B cell，Nat Med. 2018 Oct;24(10):1499-1503.

2.[cordeiro20:_late_event_treat_cd19_target] Late Events after Treatment with CD19-Targeted Chimeric Antigen Receptor Modified T Cells，Biol Blood Marrow Transplant. 2020 Jan;26(1):26-33.

3.[Fraietta2018] Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells，Nature. 2018 Jun;558(7709):307-312.

4.[Nobles2020] CD19-targeting CAR T cell immunotherapy outcomes correlate with genomic modification by vector integration，J Clin Invest. 2020 Feb 3;130(2):673-685.

内容：Zhenguo.P

编辑：Sally

校正：Chao.Z/Grace