【杰论系列】蛋白质的稳定保存策略-迈杰转化医学

【杰论系列】蛋白质的稳定保存策略

来源：时间：2021-12-10

无论是商品化蛋白还是公司内部自己开发的蛋白，在纯化获得蛋白到使用之前往往需要保存几周至几个月不等。在此期间保持蛋白理化性质的稳定至关重要。本文简要介绍了引起蛋白质聚集，沉淀，变性等现象的因素，并介绍了一些保存策略来增强蛋白质的稳定性。现在就带大家开启满满的干货之旅。

蛋白质理化性质改变的因素

蛋白质稳定性出现问题的第一个特征往往是出现沉淀，沉淀物中通常含有非天然的蛋白质聚集物，且这种聚集一般是不可逆的，通常不能够恢复天然的蛋白质结构。除非将聚集物溶解于变性液，如尿素或盐酸胍中，再通过复性去除变性液使蛋白质分子重新折叠，恢复天然构象。

（1） 剧烈刺激下的蛋白质沉淀及应对措施

多种剧烈的刺激能够引起蛋白沉淀，包括pH值变化、温度变化、冻融、在搅拌（蛋白质暴露于空气-水界面）、过滤（蛋白质暴露于液体-固体界面）等，以上因素均能够导致蛋白空间结构的变化，从而形成沉淀。

当溶液中非天然蛋白质聚集物足够小时，如二聚体，四聚体等，蛋白质能够保持可溶状态。了解这些聚集物的含量水平非常重要，因为与天然蛋白相比，其结构和活性可能已经发生了变化，即使这些聚集物维持在2%- 3%这样很低的水平，也能组装成核，从而促进蛋白质快速的聚集和沉淀。这就可以解释为什么某种蛋白在稳定的保存一段时间后，突然形成大量沉淀，可溶性聚集物在达到触发晶核生成的阈值水平之前沉淀不会发生，将含有可溶性聚集物的蛋白质暴露于剧烈的环境中，如搅拌或过滤，能够快速的促进晶核的形成和沉淀。

（2） 氨基酸侧链发生变化导致蛋白质沉淀及应对措施

除了剧烈刺激，氨基酸侧链发生变化也是蛋白沉淀的重要因素，如发生氧化和水解等会造成蛋白功能改变。

酶活性位点处的甲硫氨酸残基的氧化会导致蛋白质失活，在甲硫氨酸和半胱氨酸残基以及含有芳香族侧链的氨基酸（色氨酸，组氨酸和酪氨酸）最容易发生氧化作用，分子氧的存在、赋形剂以及容器中氧化性污染物都可以引物氧化作用，例如含有氧化还原活性的金属离子，瓶塞中含有残留的原子团杂质等均可导致氧化作用，一般加入一些稳定剂，如蔗糖，对天然状态压实，可以延缓暴露残疾的氧化率。

水解作用既可以发生在氨基酸的侧链（像天冬酰胺和谷氨酰胺残基发生的脱酰胺作用）也可以发生在肽主链上，引起肽基团的切割。天冬酰胺残基的脱酰胺作用高度取决于邻近的残基，若下一个氨基酸是甘氨酸，其降解的速度最快。多肽链局部的柔性能够影响脱酰胺作用，大多数重要的外部因子如pH值、缓冲液种类能够加速这种反应，在碱性pH和高浓度的缓冲液中，反应速度特别快。

蛋白质常见的几种保存方式

（1）在液体状态下不冻结保存

蛋白质一般在2-8℃进行短期保存，这对维持蛋白质的稳定性特别有效，然而蛋白质即使不发生聚集沉淀，也会发生缓慢的化学降解过程。

蛋白质在溶液状态下的聚集程度最小，大多数蛋白质稳定的pH范围较小，在此范围之外，蛋白质去折叠的能力加强。非特异性稳定剂，如蔗糖，在其浓度达到0.5M时，对维持蛋白质的稳定性具有较好的效果。许多添加剂，如硫酸铵，甘氨酸，聚乙二醇，蔗糖等，能够通过优先排阻（Preferential Exclusion）的方法维持蛋白质的热力学稳定性，其中柠檬酸盐缓冲液效果最佳。

另外一种维持蛋白质稳定性较好的方法是降低蛋白质的浓度，低浓度可以降低蛋白质的聚集率，这种速度对蛋白质的浓度十分敏感。然而，蛋白质的浓度也不能过低，如低于0.1mg/ml，过低浓度的蛋白会造成非特异性的吸附到容器的壁上，从而造成损失。

此外，蛋白质缓冲液的盐浓度对于维持蛋白质溶液的稳定性非常重要，如PBS缓冲液中，NaCl的浓度通常维持在150mM，这是因为溶液中离子的电荷屏蔽降低了蛋白质分子间的电荷-电荷排斥作用，这些离子浓度的选择需要具体的实验优化。

（2） 在冻结温度下保存

冷冻保存是蛋白质储存的常规方法。在低温条件下，蛋白质降解的速率降低，在低温不引起蛋白质发生变性时，样品可以稳定保存几个月，在-80℃甚至更低的温度下，蛋白的保存时间更久。

然而，冷冻也会导致许多蛋白的变性，这些因素包括低温、溶质的浓度，冰-液体界面的形成、pH值的剧烈变化等。冻存蛋白最常犯的错误是使用磷酸盐缓冲液，低温下的碱性盐结晶，而酸性盐仍然可溶，这样磷酸钠的pH值下降很多，如pH4，这会引起许多蛋白发生变性，在冷冻期间pH不太发生变化的缓冲液有柠檬酸盐、Tris、组氨酸等。

在蛋白质溶液中加入保护剂可以有效降低蛋白变性和沉淀，这些方法包括：加入甘油，盐析盐和二糖，通常浓度高于0.3M，可起到较好的作用。加入表面活性剂，其能与蛋白质分子竞争冰-液体界面来抑制蛋白质变性，通常浓度低至0.1%，就能够获得较好的效果。加入BSA或聚合物也能够抑制冷冻引起的蛋白质去折叠，一般加入比例为百分之几。通过增加蛋白质的起始浓度，能够增强在冻融过程中蛋白质制备物对损伤的耐受性。当蛋白质的起始浓度增高时，变性蛋白质分子的百分比也会下降。

对于-80℃和-20℃保存，首选-80℃。一方面低温可以较大程度降低蛋白降解速率；另一方面由于-20℃冰箱经常开关的特点，温度一般达不到-20℃，特别是靠门的地方，特别是在无霜冰箱中还会出现反复冻融的现象。而且，-20℃接近某些盐的共融点，在这个温度上下易造成晶体的反复冻融，引起蛋白质变性。最后需要强调的是，蛋白要避免反复冻融，分装冻存，每次融化一支，然后使用。

（3） 冻干保存

冻干是将溶剂或悬浮介质在低温下冷冻，然后将其由固态直接升华为气态的一种干燥方法。该方法能够很好地保持物质骨架的稳定性，并且在复融后也不改变。冻干一般包括三个过程：预冻结、升华干燥(或称第一阶段干燥)、解析干燥(或称第二阶段干燥)。

尽管冻干能够较好的维持蛋白的稳定性，但是在冻干过程中添加必要的稳定剂以防止蛋白质的变性尤为重要，这其中以非还原型的海藻糖和蔗糖对蛋白质的保护最有效。冻干过程应该避免使用还原型糖，如葡萄糖，麦芽糖，乳糖等，其会引起美拉德（Maillard）反应降解蛋白质。

在冷冻期间，保护程度取决于起始的总糖浓度；在干燥期间，保护作用取决于糖与蛋白质的质量比。冷冻保护是由于从蛋白质表面的优先排阻，这样便增加了去折叠的自由能，在干燥期间，随着与蛋白质分子表面发生水合作用的水被去除，蛋白质分子去折叠，糖能够通过在冻干蛋白质的失水位置结合氢离子来防止这种破坏。

由于冻干工艺复杂，设备昂贵，耗能较大，这是一般实验室难以承受的，通常作为蛋白保存的最后选择。对于冻干新手来说，设置以下初始条件会减少摸索时间：制备蛋白的初始浓度相对高些，能够增加对冷冻的耐受性，并减少要干燥的体积；使用足够的海藻糖或蔗糖来抑制在冷冻和干燥中的蛋白去折叠。如果蛋白质制剂能够耐受冷冻，糖与蛋白质的质量比率在1-2之间，通常能够有效的防止在干燥过程中蛋白质的去折叠。在冷冻期间，如果需要保护，糖的起始浓度通常需要达到200-300mM才能够达到最佳保护。

最后，需要明确的是蛋白质保存样本中，务必不能含有蛋白酶。蛋白酶的催化具有高效性，催化效率远远高于无机催化剂或常规的水解。在发现蛋白活性丢失时，不妨先进行SDS-PAGE跑胶，确认蛋白是否降解。在有蛋白酶存在时，可以考虑加入商业化蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的活性。

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内容：病理中心姜威

编辑：Sally

校正：Chao.Z/Grace

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