PI3K/AKT信号通路失调见于多种人类疾病，包括癌症、糖尿病、心血管疾病和神经疾病等。在癌症中，已发现两处可增强PI3K内在激酶活性的突变。另外，人类肿瘤中PTEN 常发生突变或缺失，AKT的活化突变也有报道。AKT信号转导失调造成人类疾病的频率之高， 促使 PI3K和AKT的小分子抑制剂的开发达到顶峰。
为了评估这些候选药物是否在体内“击中”了它们想要的分子靶标，经常需要开发新的检测方法， 这些检测被称为“药物活性生物标志物” 。此外，所选择的生物标志物应该能够从易于获得的样本中产生稳健且可重复的信号。在临床环境中，由于易于获取、储存和运输 的原因， 所以 血液是生物标志物测定的有利样本来源。血液样本可以提供疾病靶组织(如白血病细胞)，或者在实体瘤的情况下，正常血液成分可以为药理学研究提供替代靶标 [ 1] 。 在PI3K和AKT抑制剂的研究中， AKT/ p-AKT 检测在外周血PBMC样本和血小板样本中均有报道 [2] [3]
，血小板是PI3K的丰富来源。
先前的研究描述了PI3K在血小板激活事件级联中的明确作用 [4
] [5 ] [6 ] [7 ] 。 血小板样本可以作为一种容易获得的替代靶组织，用于测量PI3K抑制剂的效果 [8]。
AKT有2个常见的磷酸化位点：p-AKT（Thr308）和p-AKT（Ser473），一般可以利用PhosphoSitePlus数据库(https://www.phosphosite.org)查询蛋白的磷酸化情况，然后结合文献，来推测所需检测的磷酸化位点。AKT激活的磷酸化顺序一般是先苏氨酸磷酸化，后丝氨酸磷酸化，膜上的PDK1在AKT的Thr308位点将其磷酸化，导致AKT的部分激活；Ser473
位点被mTORC2磷酸化，可激 发AKT 的完全的酶活性。因此，在选择检测位点的时候，可以从作用的激酶来推测哪一个位点可能会发生变化，最直接的位点是检测 Ser473。
图1.PI3K/AKT/mTOR信号通路[9
]
AKT磷酸化的常用检测方法为蛋白质免疫印迹法（WB法）、流式细胞 术 法、配体结合法（如MSD、ELISA、CBA等）。蛋白质免疫印迹法是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，是定性测量蛋白质磷酸化水平的金标准。蛋白质印迹的灵敏度和特异性取决于所使用的抗体。WB法在临床前研究中使用较多，但由于其不能定量，方法重现性差，在临床研究中使用较少。流式细胞术
可以检测血液细胞，悬浮和贴壁细胞（不太适用于组织样本），可以对单细胞水平的磷酸化状态进行分析，并且可以通过细胞表面标记物对不同细胞亚群进行表型分析，可以使用96孔板进行大通量检测。流式细 胞术不仅快速、敏感和定量，而且还可以直接在复杂的初级样本( 如全血或外周血单个核细胞(PBMC)) 中对细胞内信号事件进行鉴别评估。流式细胞术由于上述优点，在临床试验中广泛应用。 LBA法 是临床试验中检测磷酸化蛋白最广泛的方法， LBA 法可用于细胞或组织裂解物的检测，其结果具有高度可重复性，可以对磷酸化蛋白进行定量，可以高通量进行样本检测。
由于机体外周血血小板的AKT磷酸化水平很低，采集后的外周血直接进行血小板p-AKT的检测很可能检测不到，因此需要对其进行刺激后才能检测。对收集到的样本进行刺激，扩大检测窗口，是很多磷酸化蛋白检测的常用方法。如何提取血小板，选择合适的刺激剂和刺激条件是该检测成功的关键。不同激动剂激活血小板后的AKT磷酸化水平如图2所示 [10 ] 。
图2.AKT phosphorylation in platelets after activation by different agonists
健康人全血样本在体外给药PX-866（一种PI3K抑制剂）后，血小板经TARP-6刺激处理，可以观察到PX-866对血小板磷酸化AKT有显著的抑制作用，在最高浓度(1000nM)的PX-866测试中，相对于无药物样品，抑制作用大于90%
[11]。
图3.Inhibition of P-AKT in Platelet Lysates from Normal Donor Peripheral Blood Treated Ex Vivo with PX-866
迈杰转化医学开发了一种血小板中磷酸化AKT的检测方法，已在临床试验中应用于临床样本的检测。 目前迈杰已开发多个靶点（如FTL3, STAT3, S6RP等）的磷酸化蛋白的检测方法 ，基于相关经验，我们可以根据不同客户的要求和临床中心的条件，选择最合适的方法帮客户完成相关药效评价工作。
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